1.     dPCR 相比 qPCR 的優勢有哪些？

與qPCR 相比，數字PCR具有多項優勢：

1.在定量檢測中，qPCR需要依賴標準曲線和參考品，dPCR無需依賴標準曲線和參考品，可直接進度定量檢測，并且定量精度極高，可以達到±2%-±10%的水平，而qPCR通常只能達到±50%左右的精度。

2.對于稀有突變檢測，在 qPCR 中，由于大量野生型DNA分子和少量突變型 DNA分子在同一反應體積內競爭結合引物，影響了稀有突變的檢測。相比之下，dPCR將 DNA分子分散到多個獨立的反應中，每個反應通常只包含少數幾個分子。這種分配減少了競爭，提高了檢測低豐度突變的準確性，可以將突變靈敏度從1%的水平提高到0.1%甚至0.01%的水平。

3.另一個不同點在于，在qPCR中，抑制劑會導致循環閾值(Ct)發生變化，影響結果。而在dPCR中，即使 PCR 效率下降，只要陰陽性液滴可以區分，定量分析就不會受到影響。這使得dPCR對 PCR 抑制劑的抵抗力更強，對于血液樣本，環境 DNA或廢水等復雜樣本尤為重要。

4.由于數字 PCR能夠同時運行多達200,00個反應，因此提高了精確度、靈敏度和重現性。SCI Digital PRO的自動化上樣和分液的全自動，與qPCR及其它產品相比相比，還減少了不同操作員和實驗室進行實驗時的變異性。

5.可以研究表達量變化較低的基因差異，比如在常規的RNA-Seq測試后，會采用qPCR進行結果的復核，對于表達量變化差異較小的基因，其一致性較差，這時dPCR可以帶來更高的精度，區分更小差異的變化。

2.     為何選擇更昂貴的dPCR 而非qPCR ？

n 數字 PCR 中使用的耗材比實時qPCR 略貴。但是，如果考慮到技術重復性，應比較兩到三個 qPCR 反應與一個dPCR 反應的成本。

n 此外，dPCR 比qPCR更容易進行多重檢測，當每孔分析更多目標時，還可以降低成本。因此，在某些情況下，dPCR實際上比qPCR 更便宜。

n SCI Digital PRO的超多重檢測技術，可以實現在單個芯片內達到同時檢測多達15重以上的核酸定量，更大大降低了實驗成本。

3.     如何從 qPCR 拓展到 dPCR ？引物和探針設計是否不同？

1.dPCR 中的引物探針設計指南與 qPCR 幾乎相同，這使得從 qPCR 檢測轉移到dPCR設置變得非常簡單。

2.在小海龜科技SCI Digital PRO等數字PCR平臺上，qPCR試劑兼容性非常好；如果出現部分體系無法兼容時，還可以添加促進劑進行改進。

3.當然，dPCR本身在探針設計上和qPCR也有一些差異之處，比如，qPCR更看重其擴增和剪切效率，而dPCR則更看重其特異性。

4.     dPCR的定量精度和qPCR相比，高多少？

dPCR相比qPCR，具有高精度的定量檢測能力，dPCR的精度范圍一般是±10%（拷貝數），而qPCR的精度范圍一般是±5%（Ct值）；經過單位歸一化之后，dPCR精度比qPCR高出約8倍。

圖1 dPCR和qPCR精度差異比較

5.     dPCR 所需的最小 DNA 量是多少？最大 DNA 量是多少？

1.在數字 PCR 中，測量的是單個分子，因此最小輸入量的問題不僅涉及質量，還涉及分子數量。理論上，單個分子是可以檢測到的，但在實際操作中，由于濃度極低，隨機因素對是否能捕獲該分子有顯著影響。通常情況下，大多數檢測方法和樣本基質的檢測限在3 到 10 個分子之間。

2.在數字 PCR 中，由于液滴數目的有限性，上樣量過多會導致所有液滴全部為陽性，這時只能進行定性檢測，失去了定量檢測的作用。一般2萬個液滴的芯片，最高濃度的最大上樣量在6萬拷貝/反應，也就是終濃度2000拷貝/μL。

6.     樣本間是否存在交叉污染風險？如何避免？

數字PCR芯片在上樣后會進行油封，一般不會發生污染。通常情況下，按照良好的實驗室規范操作，污染的風險極低。自動化的核酸提取儀器，更容易導致污染的發生。

7.     如何優化 dPCR 實驗？

1.使用標準化和驗證的方法提取 DNA 和 RNA，因為遺傳物質的質量會顯著影響 PCR 結果的準確性。

2.陽性對照對于驗證檢測性能和確認檢測是否正常運行至關重要，通過提供一個己知的目標來產生可預測的結果。

3.為了驗證您的檢測方法，您應該對已知樣本進行稀釋曲線分析，以確保未來測量的準確性。

4.為了確保您的 dPCR 檢測的可靠性和重現性，還應建立:

n 空白限度-可與背景噪聲區分開來的最低可檢測信號

n 檢測限-可靠檢測的最小DNA量

n 定量限-能夠準確定量評估的最低DNA量

8.     確定檢測限（LOD）的最佳實踐？

確定檢測限(LOD)涉及不同的方法，常用的方法是將 LOD 定義為 LOD 95%，即目標在95% 的概率內可被檢測到。例如，如果模板稀釋至每微升 0.2 個拷貝，相當于每個芯片中有6個分子，在 21 次測試中可能有 20 次可以檢測到，這代表了 95% 的檢出率(LOD 95)。如果量減半至每個芯片有3個拷貝，檢出率可能會降至90%，表明 LOD 為 90，而不是 95%。通常情況下會選擇95%作為檢測限標準。

9.     dPCR 需要技術重復嗎？需要哪些對照？

1.大多數人進行技術重復是為了提高精度或確保移液操作正確。第一個理由不適用于 dPCR，因為SCI Digital PRO的測量精度高于大多數移液器的工作精度，因此使用重復并不能提高精度或準確性。第二個理由的重復還是有意義的，因為 qPCR 和 dPCR 的移液操作幾乎相同。

2.為了確保結果的準確性和可靠性，陰陽性對照還是必要的；

n 理想情況下，建議運行一個陰性對照，以確保監控環境污染和體系污染(即孔中的陽性分區非常低或沒有)。陰性對照的選擇盡量采用接近樣本的模板，例如，在處理細胞時，使用不表達目的基因的細胞裂解液作為陰性對照比純水更好。

n 在驗證檢測方法時，已知的陽性對照，對于確定檢測特異性非常有用。

10.  如何解讀 dPCR 散點圖？

在一維散點圖中，每個液滴或腔室的熒光信號，都用一個點表示，橫坐標表示液滴的序號，縱坐標表示液滴的熒光強度值。通常情況下，如果1個或多個目標模板 DNA 分子存在于某個液滴中，并實現了PCR擴增時，就會產生熒光信號(基于探針或EvaGreen染料)。通常，一個有陽性模板樣本的結果，會在散點圖上看到兩個聚類的信號層，上面的聚類的是陽性(含有1個或多個分子)，下面的聚類為陰性(不含分子)。系統軟件或用戶手動設置兩個聚類之間的閾值，以確定哪些液滴為陽性，哪些為陰性。然后使用泊松公式計算，以確定樣品中的分子數量。

圖2 數字PCR擴增后的熒光圖像和散點圖

11.  不確定度（%）的含義是什么

不確定度（%）是一個基于泊松分布計算出的統計值，是精密度的一種表現形式，數值越大，結果精度約低。這個值主要受陽性液滴數的影響，主要用于指示樣本的濃度是否處于適合合適的 dPCR 的精確定量范圍內。如果不確定度（%）為 10% 或更低，則無需調整。如果置信區間較高，則最好根據情況使用稍多（通常需要提高濃度）或稍少的 DNA。

當樣本濃度本身就較低時，不確定度（%）無法達到10%以下時，是否表示結果不可靠呢？不是的！

這致意味著你的結果在 10%的精度下略顯不可靠。換句話說，當你在較低拷貝數時，測量樣本之間的微小差異會變得更加困難。請注意即使在這些階段精度較低，dPCR仍然比其他分子技術如 qPCR 更可靠。

圖3 精密度（不確定度）和陽性率/陰性率關系

12.  如何手動設置閾值？

dPCR 中進行定量的統計學公式是泊松分布，基于將陰性或陽性液滴的比例，而這一判斷則由液滴的熒光信號強度決定。SCI Digital PRO軟件會自動設置某個閾值，但也可以手動調整。尤其是，對于全陰性或全陽性樣本時，軟件無法預先判斷改歸為陰性或是陽性。

這種手動調整非常靈活，您可以隨意設定。雖然感覺有些隨意，但實際上與流式細胞術、qPCR 或凝膠電泳分析時設置閾值幾乎沒有區別。同樣地，NGS也依賴于指標來確定一定數量的reads為真實的reads或噪聲。

SCI Digital PRO對閾值提供了一個特殊的功能，如果是已經開發成熟的試劑盒，可以根據前期經驗進行閾值的預設，這樣會避免對于全陰性或全陽性樣本的自動閾值生成時的偏差，更利于臨床檢測的自動化。

13.  什么是“雨點”現象？如何減少？

1.在數字 PCR 數據中，正負結果之間的清晰分離(信噪比)至關重要。這里“雨點”指的是那些既不明顯呈陽性也不明顯呈陰性的中間部分，這些“雨點”的存在會導致閾值的難以界定。這些“雨點”信號受到 PCR 效率、PCR 抑制劑的存在以及非靶向結合等因素的影響。

PCR 參數的調整有助于解決這些“雨點”。例如：

n 提高退火溫度以減少脫靶結合并明確正負信號之間的分離，這種方法有助于確定“雨點”分區是由于效率降低還是脫靶效應。

n 優化引物和探針濃度

n 調整 PCR 循環次數

n 調整退火和延伸時間

2.如果上述方案仍舊無法接近，需要考慮重新設計更合適的引物或探針，以及更換適合的檢測體系（酶或buffer）

3.特別強調的是，針對環狀質粒DNA，需要進行酶切線性化處理；否則，很容易出現“雨點”現象！（超螺旋，解鏈難度大）

圖4 數字PCR“雨點”現象示例

14.  一維圖像出現雙陽性條帶意味著什么？

這可能意味著存在非特異性擴增。如果你的 NTC是干凈的，你可以嘗試提高退火溫度以使反應更加嚴格。如果在多重檢測過程中觀察到這種情況，則不會影響目標的濃度或豐度。

15.  什么會導致過飽和？

過度飽和是由于樣本過載引起的，表現為僅存在正向分區。在這種情況下，定量不再準確，因為dPCR 中使用的統計模型假設隨機分布，這需要一定數量的分區為空。

為了避免未知濃度樣品過飽和，可以先進行系列稀釋，觀察在哪個稀釋度下獲得最佳信噪比。如果采用多重檢測，建議先單獨優化每個目標(單重檢測)，然后再逐個進行多重檢測(雙重、三重等)

16.  如何進行多重檢測？

在進行多重檢測時，首先采用不同的熒光通道去標記不同靶點探針：

以下是設計多重檢測的幾個提示：

1.設計引物探針時需要進行多重比對分析；

2. 選擇具有相似 PCR 條件的引物探針；

3. 模板 (C)DNA 中具有相似濃度的多重靶標；

4. 減少模板量可以減少檢測之間的干擾；

圖5 SCI Digital PRO六色熒光多重實例

5. 使用 2:1 的引物和探針比例

建議選擇800 nM引物和 400 nM探針用于單重檢測，如果您需要檢測雙重檢測以上，可以嘗試降低濃度

17.  能否設置不同溫度程序？梯度 dPCR 是否可行？

SCI Dgital PRO具有兩個不同的溫擴模塊，兩個模塊可以進行獨立控制，設置不同的溫擴程序；

SCI Digital PRO的每一個獨立模塊，還可以設置溫度梯度功能，可以運行溫度梯度程序，溫度從左到右的6個位置可以具有不同的溫度。

18.  能使用哪些染料或預混液？

SCI Digital PRO儀器具有FAM(VIC)、HEX、ROX、Cy5、Q705、Atto425等熒光通道，相關波長的探針均可使用；

還可使用EvaGreen和PicoGreen染料；染料法無法實現多重檢測，且對引物的特異性要求更高！

SCI Digital PRO dPCR 具有配套的經過優化后的通用預混液和酶。大部分客戶的通用體系也可以使用，少量客戶的體系可能兼容性不好（可以增加促進劑改善）；建議優選SCI Digital PRO dPCR配套的試劑盒。

19.  檢測稀有DNA時是否需要標準化濃度？

通常，使用相似濃度的 DNA有助于樣本之間的比較。然而，在處理珍貴的 DNA樣本時，最好省略這一步驟。

20.  dPCR 在全基因組測序（WGS）中的應用優勢？

雖然 WGS 涉及對整個 DNA 進行測序而不使用特定引物，但 dPCR 需要針對已知目標設計的引物和探針。數字 PCR 在 WGS 研究中特別有用，可以進一步調査研究過程中確定的具體目標。通過設計特定的引物和探針，研究人員可以利用 dPCR 驗證并量化 WGS 研究的結果。此外，dPCR 有助于準確量化用于測序的文庫，這可以通過減少文庫的質量問題來降低成本。

21.  dPCR 是否適用于表觀遺傳學研究？

dPCR 對于低濃度樣本的精確定量對于表觀遺傳學研究非常有利，因為不太敏感的方法很容易錯過表觀遺傳變化的低水平表達檢測。

22.  如何用 dPCR 檢測拷貝數變異（CNV）？

對于 CNV 檢測，工作流程與 qPCR 非常相似。通常情況下，分別檢測目標基因和內參基因。當然，也可以把內參可目標基因放在一個體系內同時檢測。然后，根據目標基因和內參基因拷貝數直接進行計算即可。特別注意的是，dPCR相比于qPCR，檢測定量動態范圍較小，內參基因和目標基因的表達差異不易過大，大部分高表達的qPCR內參在dPCR中進行低表達量基因的檢測時不太適用（除非分開檢測，進行不同比例的稀釋）。

23.  如何用 dPCR 定量囊泡和血漿中的 miRNA ？

數字 PCR 可用于量化囊泡和血漿樣本中的 miRNA。由于 miRNA 的表達量相對較低，尤其是在血漿中，dPCR 提供了高靈敏度和精確度，能夠檢測低水平的 miRNA 并監測其進展。miRNA的檢測，需要特別注意其樣本提取和體系設計，尤其是引物的特異性至關重要。

24.  dPCR 在傳染病中的應用？

dPCR 可用于感染疾病的研究。尤其是對于血液中的病原體感染，dPCR具有較大的優勢；小海龜科技開發的SCI Digital PRO數字PCR系統，不僅可以實現多重的病原體檢測，還可以實現超多重的病原體檢測，通過多色熒光編解碼技術，實現在1張芯片，1個反應內檢測超過15種不同的病原體或耐藥基因型。

25.  dPCR 在污水分析中的靈敏度、抑制效應和成本效益？

dPCR在污水病原體檢測和回溯的研究中，通常，其檢測限與 qPCR 相比更優，檢測限則在5到10分子之間。在 PCR 抑制方面，dPCR的抑制問題明顯較少。

在許多情況下，dPCR 所需的重復次數比 qPCR 少，所以即使每個反應的成本在 dPCR 中更高，但總成本可能不會像 qPCR 那樣高。

26.  dPCR 在環境 DNA（eDNA）中的應用？

dPCR可用于許多涉及環境 DNA 的項目，包括水質監測、土壤微生物測量或從水樣中追蹤海洋生物。dPCR 在這里的優勢在于更高的靈敏度和對抑制劑的耐受性。SCI Digital PRO在處理復雜樣本基質時表現非常出色，在長江江豚eDNA檢測中具有非常好的效果。

27.   dPCR 的未來應用方向

在細胞和基因治療領域中，dPCR的應用非常廣泛。包括生產攜帶基因或細胞的生物基質，在生產過程中的許多步驟中，數字 PCR 可以用來控制產品質量。其他新興領域還包括基于污水的流行病學檢測和食品病原體的定量檢測(如奶粉，益生菌，海洋水產品等)。

此外，很多基于 PCR的應用，如臨床檢測，尤其是在腫瘤學領域，最終可能會轉向 dPCR。