1.     dPCR 相比 qPCR 的優(yōu)勢(shì)有哪些？

與qPCR 相比，數(shù)字PCR具有多項(xiàng)優(yōu)勢(shì)：

1.在定量檢測(cè)中，qPCR需要依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線和參考品，dPCR無需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線和參考品，可直接進(jìn)度定量檢測(cè)，并且定量精度極高，可以達(dá)到±2%-±10%的水平，而qPCR通常只能達(dá)到±50%左右的精度。

2.對(duì)于稀有突變檢測(cè)，在 qPCR 中，由于大量野生型DNA分子和少量突變型 DNA分子在同一反應(yīng)體積內(nèi)競爭結(jié)合引物，影響了稀有突變的檢測(cè)。相比之下，dPCR將 DNA分子分散到多個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)中，每個(gè)反應(yīng)通常只包含少數(shù)幾個(gè)分子。這種分配減少了競爭，提高了檢測(cè)低豐度突變的準(zhǔn)確性，可以將突變靈敏度從1%的水平提高到0.1%甚至0.01%的水平。

3.另一個(gè)不同點(diǎn)在于，在qPCR中，抑制劑會(huì)導(dǎo)致循環(huán)閾值(Ct)發(fā)生變化，影響結(jié)果。而在dPCR中，即使 PCR 效率下降，只要陰陽性液滴可以區(qū)分，定量分析就不會(huì)受到影響。這使得dPCR對(duì) PCR 抑制劑的抵抗力更強(qiáng)，對(duì)于血液樣本，環(huán)境 DNA或廢水等復(fù)雜樣本尤為重要。

4.由于數(shù)字 PCR能夠同時(shí)運(yùn)行多達(dá)200,00個(gè)反應(yīng)，因此提高了精確度、靈敏度和重現(xiàn)性。SCI Digital PRO的自動(dòng)化上樣和分液的全自動(dòng)，與qPCR及其它產(chǎn)品相比相比，還減少了不同操作員和實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)的變異性。

5.可以研究表達(dá)量變化較低的基因差異，比如在常規(guī)的RNA-Seq測(cè)試后，會(huì)采用qPCR進(jìn)行結(jié)果的復(fù)核，對(duì)于表達(dá)量變化差異較小的基因，其一致性較差，這時(shí)dPCR可以帶來更高的精度，區(qū)分更小差異的變化。

2.     為何選擇更昂貴的dPCR 而非qPCR ？

n 數(shù)字 PCR 中使用的耗材比實(shí)時(shí)qPCR 略貴。但是，如果考慮到技術(shù)重復(fù)性，應(yīng)比較兩到三個(gè) qPCR 反應(yīng)與一個(gè)dPCR 反應(yīng)的成本。

n 此外，dPCR 比qPCR更容易進(jìn)行多重檢測(cè)，當(dāng)每孔分析更多目標(biāo)時(shí)，還可以降低成本。因此，在某些情況下，dPCR實(shí)際上比qPCR 更便宜。

n SCI Digital PRO的超多重檢測(cè)技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)在單個(gè)芯片內(nèi)達(dá)到同時(shí)檢測(cè)多達(dá)15重以上的核酸定量，更大大降低了實(shí)驗(yàn)成本。

3.     如何從 qPCR 拓展到 dPCR ？引物和探針設(shè)計(jì)是否不同？

1.dPCR 中的引物探針設(shè)計(jì)指南與 qPCR 幾乎相同，這使得從 qPCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)移到dPCR設(shè)置變得非常簡單。

2.在小海龜科技SCI Digital PRO等數(shù)字PCR平臺(tái)上，qPCR試劑兼容性非常好；如果出現(xiàn)部分體系無法兼容時(shí)，還可以添加促進(jìn)劑進(jìn)行改進(jìn)。

3.當(dāng)然，dPCR本身在探針設(shè)計(jì)上和qPCR也有一些差異之處，比如，qPCR更看重其擴(kuò)增和剪切效率，而dPCR則更看重其特異性。

4.     dPCR的定量精度和qPCR相比，高多少？

dPCR相比qPCR，具有高精度的定量檢測(cè)能力，dPCR的精度范圍一般是±10%（拷貝數(shù)），而qPCR的精度范圍一般是±5%（Ct值）；經(jīng)過單位歸一化之后，dPCR精度比qPCR高出約8倍。

圖1 dPCR和qPCR精度差異比較

5.     dPCR 所需的最小 DNA 量是多少？最大 DNA 量是多少？

1.在數(shù)字 PCR 中，測(cè)量的是單個(gè)分子，因此最小輸入量的問題不僅涉及質(zhì)量，還涉及分子數(shù)量。理論上，單個(gè)分子是可以檢測(cè)到的，但在實(shí)際操作中，由于濃度極低，隨機(jī)因素對(duì)是否能捕獲該分子有顯著影響。通常情況下，大多數(shù)檢測(cè)方法和樣本基質(zhì)的檢測(cè)限在3 到 10 個(gè)分子之間。

2.在數(shù)字 PCR 中，由于液滴數(shù)目的有限性，上樣量過多會(huì)導(dǎo)致所有液滴全部為陽性，這時(shí)只能進(jìn)行定性檢測(cè)，失去了定量檢測(cè)的作用。一般2萬個(gè)液滴的芯片，最高濃度的最大上樣量在6萬拷貝/反應(yīng)，也就是終濃度2000拷貝/μL。

6.     樣本間是否存在交叉污染風(fēng)險(xiǎn)？如何避免？

數(shù)字PCR芯片在上樣后會(huì)進(jìn)行油封，一般不會(huì)發(fā)生污染。通常情況下，按照良好的實(shí)驗(yàn)室規(guī)范操作，污染的風(fēng)險(xiǎn)極低。自動(dòng)化的核酸提取儀器，更容易導(dǎo)致污染的發(fā)生。

7.     如何優(yōu)化 dPCR 實(shí)驗(yàn)？

1.使用標(biāo)準(zhǔn)化和驗(yàn)證的方法提取 DNA 和 RNA，因?yàn)檫z傳物質(zhì)的質(zhì)量會(huì)顯著影響 PCR 結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.陽性對(duì)照對(duì)于驗(yàn)證檢測(cè)性能和確認(rèn)檢測(cè)是否正常運(yùn)行至關(guān)重要，通過提供一個(gè)己知的目標(biāo)來產(chǎn)生可預(yù)測(cè)的結(jié)果。

3.為了驗(yàn)證您的檢測(cè)方法，您應(yīng)該對(duì)已知樣本進(jìn)行稀釋曲線分析，以確保未來測(cè)量的準(zhǔn)確性。

4.為了確保您的 dPCR 檢測(cè)的可靠性和重現(xiàn)性，還應(yīng)建立:

n 空白限度-可與背景噪聲區(qū)分開來的最低可檢測(cè)信號(hào)

n 檢測(cè)限-可靠檢測(cè)的最小DNA量

n 定量限-能夠準(zhǔn)確定量評(píng)估的最低DNA量

8.     確定檢測(cè)限（LOD）的最佳實(shí)踐？

確定檢測(cè)限(LOD)涉及不同的方法，常用的方法是將 LOD 定義為 LOD 95%，即目標(biāo)在95% 的概率內(nèi)可被檢測(cè)到。例如，如果模板稀釋至每微升 0.2 個(gè)拷貝，相當(dāng)于每個(gè)芯片中有6個(gè)分子，在 21 次測(cè)試中可能有 20 次可以檢測(cè)到，這代表了 95% 的檢出率(LOD 95)。如果量減半至每個(gè)芯片有3個(gè)拷貝，檢出率可能會(huì)降至90%，表明 LOD 為 90，而不是 95%。通常情況下會(huì)選擇95%作為檢測(cè)限標(biāo)準(zhǔn)。

9.     dPCR 需要技術(shù)重復(fù)嗎？需要哪些對(duì)照？

1.大多數(shù)人進(jìn)行技術(shù)重復(fù)是為了提高精度或確保移液操作正確。第一個(gè)理由不適用于 dPCR，因?yàn)镾CI Digital PRO的測(cè)量精度高于大多數(shù)移液器的工作精度，因此使用重復(fù)并不能提高精度或準(zhǔn)確性。第二個(gè)理由的重復(fù)還是有意義的，因?yàn)?nbsp;qPCR 和 dPCR 的移液操作幾乎相同。

2.為了確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，陰陽性對(duì)照還是必要的；

n 理想情況下，建議運(yùn)行一個(gè)陰性對(duì)照，以確保監(jiān)控環(huán)境污染和體系污染(即孔中的陽性分區(qū)非常低或沒有)。陰性對(duì)照的選擇盡量采用接近樣本的模板，例如，在處理細(xì)胞時(shí)，使用不表達(dá)目的基因的細(xì)胞裂解液作為陰性對(duì)照比純水更好。

n 在驗(yàn)證檢測(cè)方法時(shí)，已知的陽性對(duì)照，對(duì)于確定檢測(cè)特異性非常有用。

10.  如何解讀 dPCR 散點(diǎn)圖？

在一維散點(diǎn)圖中，每個(gè)液滴或腔室的熒光信號(hào)，都用一個(gè)點(diǎn)表示，橫坐標(biāo)表示液滴的序號(hào)，縱坐標(biāo)表示液滴的熒光強(qiáng)度值。通常情況下，如果1個(gè)或多個(gè)目標(biāo)模板 DNA 分子存在于某個(gè)液滴中，并實(shí)現(xiàn)了PCR擴(kuò)增時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)(基于探針或EvaGreen染料)。通常，一個(gè)有陽性模板樣本的結(jié)果，會(huì)在散點(diǎn)圖上看到兩個(gè)聚類的信號(hào)層，上面的聚類的是陽性(含有1個(gè)或多個(gè)分子)，下面的聚類為陰性(不含分子)。系統(tǒng)軟件或用戶手動(dòng)設(shè)置兩個(gè)聚類之間的閾值，以確定哪些液滴為陽性，哪些為陰性。然后使用泊松公式計(jì)算，以確定樣品中的分子數(shù)量。

圖2 數(shù)字PCR擴(kuò)增后的熒光圖像和散點(diǎn)圖

11.  不確定度（%）的含義是什么

不確定度（%）是一個(gè)基于泊松分布計(jì)算出的統(tǒng)計(jì)值，是精密度的一種表現(xiàn)形式，數(shù)值越大，結(jié)果精度約低。這個(gè)值主要受陽性液滴數(shù)的影響，主要用于指示樣本的濃度是否處于適合合適的 dPCR 的精確定量范圍內(nèi)。如果不確定度（%）為 10% 或更低，則無需調(diào)整。如果置信區(qū)間較高，則最好根據(jù)情況使用稍多（通常需要提高濃度）或稍少的 DNA。

當(dāng)樣本濃度本身就較低時(shí)，不確定度（%）無法達(dá)到10%以下時(shí)，是否表示結(jié)果不可靠呢？不是的！

這致意味著你的結(jié)果在 10%的精度下略顯不可靠。換句話說，當(dāng)你在較低拷貝數(shù)時(shí)，測(cè)量樣本之間的微小差異會(huì)變得更加困難。請(qǐng)注意即使在這些階段精度較低，dPCR仍然比其他分子技術(shù)如 qPCR 更可靠。

圖3 精密度（不確定度）和陽性率/陰性率關(guān)系

12.  如何手動(dòng)設(shè)置閾值？

dPCR 中進(jìn)行定量的統(tǒng)計(jì)學(xué)公式是泊松分布，基于將陰性或陽性液滴的比例，而這一判斷則由液滴的熒光信號(hào)強(qiáng)度決定。SCI Digital PRO軟件會(huì)自動(dòng)設(shè)置某個(gè)閾值，但也可以手動(dòng)調(diào)整。尤其是，對(duì)于全陰性或全陽性樣本時(shí)，軟件無法預(yù)先判斷改歸為陰性或是陽性。

這種手動(dòng)調(diào)整非常靈活，您可以隨意設(shè)定。雖然感覺有些隨意，但實(shí)際上與流式細(xì)胞術(shù)、qPCR 或凝膠電泳分析時(shí)設(shè)置閾值幾乎沒有區(qū)別。同樣地，NGS也依賴于指標(biāo)來確定一定數(shù)量的reads為真實(shí)的reads或噪聲。

SCI Digital PRO對(duì)閾值提供了一個(gè)特殊的功能，如果是已經(jīng)開發(fā)成熟的試劑盒，可以根據(jù)前期經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行閾值的預(yù)設(shè)，這樣會(huì)避免對(duì)于全陰性或全陽性樣本的自動(dòng)閾值生成時(shí)的偏差，更利于臨床檢測(cè)的自動(dòng)化。

13.  什么是“雨點(diǎn)”現(xiàn)象？如何減少？

1.在數(shù)字 PCR 數(shù)據(jù)中，正負(fù)結(jié)果之間的清晰分離(信噪比)至關(guān)重要。這里“雨點(diǎn)”指的是那些既不明顯呈陽性也不明顯呈陰性的中間部分，這些“雨點(diǎn)”的存在會(huì)導(dǎo)致閾值的難以界定。這些“雨點(diǎn)”信號(hào)受到 PCR 效率、PCR 抑制劑的存在以及非靶向結(jié)合等因素的影響。

PCR 參數(shù)的調(diào)整有助于解決這些“雨點(diǎn)”。例如：

n 提高退火溫度以減少脫靶結(jié)合并明確正負(fù)信號(hào)之間的分離，這種方法有助于確定“雨點(diǎn)”分區(qū)是由于效率降低還是脫靶效應(yīng)。

n 優(yōu)化引物和探針濃度

n 調(diào)整 PCR 循環(huán)次數(shù)

n 調(diào)整退火和延伸時(shí)間

2.如果上述方案仍舊無法接近，需要考慮重新設(shè)計(jì)更合適的引物或探針，以及更換適合的檢測(cè)體系（酶或buffer）

3.特別強(qiáng)調(diào)的是，針對(duì)環(huán)狀質(zhì)粒DNA，需要進(jìn)行酶切線性化處理；否則，很容易出現(xiàn)“雨點(diǎn)”現(xiàn)象！（超螺旋，解鏈難度大）

圖4 數(shù)字PCR“雨點(diǎn)”現(xiàn)象示例

14.  一維圖像出現(xiàn)雙陽性條帶意味著什么？

這可能意味著存在非特異性擴(kuò)增。如果你的 NTC是干凈的，你可以嘗試提高退火溫度以使反應(yīng)更加嚴(yán)格。如果在多重檢測(cè)過程中觀察到這種情況，則不會(huì)影響目標(biāo)的濃度或豐度。

15.  什么會(huì)導(dǎo)致過飽和？

過度飽和是由于樣本過載引起的，表現(xiàn)為僅存在正向分區(qū)。在這種情況下，定量不再準(zhǔn)確，因?yàn)閐PCR 中使用的統(tǒng)計(jì)模型假設(shè)隨機(jī)分布，這需要一定數(shù)量的分區(qū)為空。

為了避免未知濃度樣品過飽和，可以先進(jìn)行系列稀釋，觀察在哪個(gè)稀釋度下獲得最佳信噪比。如果采用多重檢測(cè)，建議先單獨(dú)優(yōu)化每個(gè)目標(biāo)(單重檢測(cè))，然后再逐個(gè)進(jìn)行多重檢測(cè)(雙重、三重等)

16.  如何進(jìn)行多重檢測(cè)？

在進(jìn)行多重檢測(cè)時(shí)，首先采用不同的熒光通道去標(biāo)記不同靶點(diǎn)探針：

以下是設(shè)計(jì)多重檢測(cè)的幾個(gè)提示：

1.設(shè)計(jì)引物探針時(shí)需要進(jìn)行多重比對(duì)分析；

2. 選擇具有相似 PCR 條件的引物探針；

3. 模板 (C)DNA 中具有相似濃度的多重靶標(biāo)；

4. 減少模板量可以減少檢測(cè)之間的干擾；

圖5 SCI Digital PRO六色熒光多重實(shí)例

5. 使用 2:1 的引物和探針比例

建議選擇800 nM引物和 400 nM探針用于單重檢測(cè)，如果您需要檢測(cè)雙重檢測(cè)以上，可以嘗試降低濃度

17.  能否設(shè)置不同溫度程序？梯度 dPCR 是否可行？

SCI Dgital PRO具有兩個(gè)不同的溫?cái)U(kuò)模塊，兩個(gè)模塊可以進(jìn)行獨(dú)立控制，設(shè)置不同的溫?cái)U(kuò)程序；

SCI Digital PRO的每一個(gè)獨(dú)立模塊，還可以設(shè)置溫度梯度功能，可以運(yùn)行溫度梯度程序，溫度從左到右的6個(gè)位置可以具有不同的溫度。

18.  能使用哪些染料或預(yù)混液？

SCI Digital PRO儀器具有FAM(VIC)、HEX、ROX、Cy5、Q705、Atto425等熒光通道，相關(guān)波長的探針均可使用；

還可使用EvaGreen和PicoGreen染料；染料法無法實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)，且對(duì)引物的特異性要求更高！

SCI Digital PRO dPCR 具有配套的經(jīng)過優(yōu)化后的通用預(yù)混液和酶。大部分客戶的通用體系也可以使用，少量客戶的體系可能兼容性不好（可以增加促進(jìn)劑改善）；建議優(yōu)選SCI Digital PRO dPCR配套的試劑盒。

19.  檢測(cè)稀有DNA時(shí)是否需要標(biāo)準(zhǔn)化濃度？

通常，使用相似濃度的 DNA有助于樣本之間的比較。然而，在處理珍貴的 DNA樣本時(shí)，最好省略這一步驟。

20.  dPCR 在全基因組測(cè)序（WGS）中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)？

雖然 WGS 涉及對(duì)整個(gè) DNA 進(jìn)行測(cè)序而不使用特定引物，但 dPCR 需要針對(duì)已知目標(biāo)設(shè)計(jì)的引物和探針。數(shù)字 PCR 在 WGS 研究中特別有用，可以進(jìn)一步調(diào)査研究過程中確定的具體目標(biāo)。通過設(shè)計(jì)特定的引物和探針，研究人員可以利用 dPCR 驗(yàn)證并量化 WGS 研究的結(jié)果。此外，dPCR 有助于準(zhǔn)確量化用于測(cè)序的文庫，這可以通過減少文庫的質(zhì)量問題來降低成本。

21.  dPCR 是否適用于表觀遺傳學(xué)研究？

dPCR 對(duì)于低濃度樣本的精確定量對(duì)于表觀遺傳學(xué)研究非常有利，因?yàn)椴惶舾械姆椒ê苋菀族e(cuò)過表觀遺傳變化的低水平表達(dá)檢測(cè)。

22.  如何用 dPCR 檢測(cè)拷貝數(shù)變異（CNV）？

對(duì)于 CNV 檢測(cè)，工作流程與 qPCR 非常相似。通常情況下，分別檢測(cè)目標(biāo)基因和內(nèi)參基因。當(dāng)然，也可以把內(nèi)參可目標(biāo)基因放在一個(gè)體系內(nèi)同時(shí)檢測(cè)。然后，根據(jù)目標(biāo)基因和內(nèi)參基因拷貝數(shù)直接進(jìn)行計(jì)算即可。特別注意的是，dPCR相比于qPCR，檢測(cè)定量動(dòng)態(tài)范圍較小，內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的表達(dá)差異不易過大，大部分高表達(dá)的qPCR內(nèi)參在dPCR中進(jìn)行低表達(dá)量基因的檢測(cè)時(shí)不太適用（除非分開檢測(cè)，進(jìn)行不同比例的稀釋）。

23.  如何用 dPCR 定量囊泡和血漿中的 miRNA ？

數(shù)字 PCR 可用于量化囊泡和血漿樣本中的 miRNA。由于 miRNA 的表達(dá)量相對(duì)較低，尤其是在血漿中，dPCR 提供了高靈敏度和精確度，能夠檢測(cè)低水平的 miRNA 并監(jiān)測(cè)其進(jìn)展。miRNA的檢測(cè)，需要特別注意其樣本提取和體系設(shè)計(jì)，尤其是引物的特異性至關(guān)重要。

24.  dPCR 在傳染病中的應(yīng)用？

dPCR 可用于感染疾病的研究。尤其是對(duì)于血液中的病原體感染，dPCR具有較大的優(yōu)勢(shì)；小海龜科技開發(fā)的SCI Digital PRO數(shù)字PCR系統(tǒng)，不僅可以實(shí)現(xiàn)多重的病原體檢測(cè)，還可以實(shí)現(xiàn)超多重的病原體檢測(cè)，通過多色熒光編解碼技術(shù)，實(shí)現(xiàn)在1張芯片，1個(gè)反應(yīng)內(nèi)檢測(cè)超過15種不同的病原體或耐藥基因型。

25.  dPCR 在污水分析中的靈敏度、抑制效應(yīng)和成本效益？

dPCR在污水病原體檢測(cè)和回溯的研究中，通常，其檢測(cè)限與 qPCR 相比更優(yōu)，檢測(cè)限則在5到10分子之間。在 PCR 抑制方面，dPCR的抑制問題明顯較少。

在許多情況下，dPCR 所需的重復(fù)次數(shù)比 qPCR 少，所以即使每個(gè)反應(yīng)的成本在 dPCR 中更高，但總成本可能不會(huì)像 qPCR 那樣高。

26.  dPCR 在環(huán)境 DNA（eDNA）中的應(yīng)用？

dPCR可用于許多涉及環(huán)境 DNA 的項(xiàng)目，包括水質(zhì)監(jiān)測(cè)、土壤微生物測(cè)量或從水樣中追蹤海洋生物。dPCR 在這里的優(yōu)勢(shì)在于更高的靈敏度和對(duì)抑制劑的耐受性。SCI Digital PRO在處理復(fù)雜樣本基質(zhì)時(shí)表現(xiàn)非常出色，在長江江豚eDNA檢測(cè)中具有非常好的效果。

27.   dPCR 的未來應(yīng)用方向

在細(xì)胞和基因治療領(lǐng)域中，dPCR的應(yīng)用非常廣泛。包括生產(chǎn)攜帶基因或細(xì)胞的生物基質(zhì)，在生產(chǎn)過程中的許多步驟中，數(shù)字 PCR 可以用來控制產(chǎn)品質(zhì)量。其他新興領(lǐng)域還包括基于污水的流行病學(xué)檢測(cè)和食品病原體的定量檢測(cè)(如奶粉，益生菌，海洋水產(chǎn)品等)。

此外，很多基于 PCR的應(yīng)用，如臨床檢測(cè)，尤其是在腫瘤學(xué)領(lǐng)域，最終可能會(huì)轉(zhuǎn)向 dPCR。