流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備

流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)象是單細(xì)胞懸液，因此需把樣品制備成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為10⁵～10⁷個(gè)／ml。制備成的單細(xì)胞懸液經(jīng)熒光或免疫熒光標(biāo)記即可上機(jī)檢測(cè)。

樣本制備的基本原則：1.使各種液體和懸浮細(xì)胞樣本新鮮，盡快完成樣本制備和檢測(cè)；2.針對(duì)不同的細(xì)胞樣本進(jìn)行適當(dāng)洗滌、酶消化或EDTA處理，以清除雜質(zhì)，使粘附的細(xì)胞彼此分離而形成單細(xì)胞狀態(tài)；3.對(duì)新鮮實(shí)體瘤組織可選用或聯(lián)用酶消化法，機(jī)械打散法和化學(xué)分散法來(lái)獲得足夠數(shù)量的單細(xì)胞懸液；4.對(duì)石蠟包埋組織應(yīng)先切成若干40-50μm厚的蠟片，經(jīng)二甲苯脫蠟到水后，再用前述方法制備單細(xì)胞懸液；5.單細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)不應(yīng)少于10⁷個(gè)/ml。

 一、新鮮實(shí)體組織樣本的制備

 （一）酶處理法  此法是實(shí)體組織分散為單個(gè)細(xì)胞的主要方法。由于不同酶對(duì)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間不同組分有特異消化作用，所以應(yīng)根據(jù)所用組織類型確定使用酶的種類。此外，乙二胺四乙酸(EDTA)能結(jié)合組織中的二價(jià)鈣離子和鎂離子，而二價(jià)鈣離子和鎂離子有維持細(xì)胞表面完整性和維持細(xì)胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，因此，幾種酶和EDTA聯(lián)合使用有助于充分消化實(shí)體組織，提高細(xì)胞產(chǎn)出效率。下面僅介紹組織消化的一般過(guò)程，對(duì)于每種組織消化時(shí)所用的具體步驟需參考該組織細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的消化方法。

1．將組織剪成l～2mm3左右的小塊。

2．用胰蛋白酶或膠原酶消化組織塊，胰蛋白酶適用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、上皮、肝、腎等組織。胰蛋白酶工作濃度一般為0．1％～0．5％。對(duì)于纖維較多的組織或較硬的癌組織常用0．25％膠原酶，膠原酶對(duì)組織中膠原蛋白類結(jié)構(gòu)消化作用強(qiáng)，它僅對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有消化作用而對(duì)上皮細(xì)胞影響不大。膠原酶常用劑量為0．1～0．3ug／ml。用大于組織量30～50倍的胰蛋白酶液或膠原酶液在37℃條件下消化組織，需每隔一定時(shí)間搖動(dòng)一次。消化時(shí)間的長(zhǎng)短依組織類型而定，一般來(lái)說(shuō)，胰蛋白酶需作用20～60分鐘，膠原酶需4～48小時(shí)。在消化過(guò)程中，如發(fā)現(xiàn)組織塊已分散而失去塊的形狀，經(jīng)搖動(dòng)即可成為絮狀懸液，則可取出少量液體在顯微鏡下觀察，可見分散的單個(gè)細(xì)胞和少量的細(xì)胞團(tuán)，可認(rèn)為組織已消化充分。

3．消化完畢后，將細(xì)胞懸液通過(guò)100目孔徑尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)濾過(guò)，以除掉未充分消化的組織。

4．已過(guò)濾的細(xì)胞懸液經(jīng)800～1000rpm低速離心5～10分鐘后，棄上清液，加PBS液，輕輕吹打形成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后即可使用。

（二）機(jī)械法  機(jī)械法分散實(shí)體組織，用手術(shù)剪刀剪碎組織、用鋒利的解剖刀剁碎組織或用勻漿器制成組織勻漿，再用細(xì)注射針頭抽吸細(xì)胞或用300目尼龍網(wǎng)濾除單細(xì)胞懸液；采用網(wǎng)搓法也能獲得大量細(xì)胞。機(jī)械法易造成細(xì)胞碎片和細(xì)胞團(tuán)塊，所以常與其他方法配合使用。

1．剪碎法

（1）將組織塊放入平皿中，加入少量生理鹽水；

（2）用剪刀將組織剪至勻漿狀；

（3）加入10ml生理鹽水；

（4）用吸管吸取組織勻漿，先以100目尼龍網(wǎng)過(guò)濾到試管中；

（5）離心沉淀1000r/min，4~5min，再用生理鹽水洗3遍，每次以低速（500~800r/min）短時(shí)離心沉淀去除細(xì)胞碎片。

（6）以300目尼龍網(wǎng)濾去細(xì)胞團(tuán)塊；

（7）細(xì)胞用固定液固定或低溫保存?zhèn)溆谩?/span>

2．網(wǎng)搓法

（1）將100目、300目尼龍網(wǎng)扎在小燒杯上；

（2）把剪碎的組織放在網(wǎng)上，以眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊加生理鹽水沖洗，直到將組織搓完；

（3）收集細(xì)胞懸液，500~800r/min離心沉淀2min；

（4）固定細(xì)胞或低溫保存?zhèn)溆谩?/span>

3．研磨法

（1）先將組織剪成1~2mm2 大小組織塊；

（2）放入組織研磨器中加入1~2ml生理鹽水；

（3）轉(zhuǎn)動(dòng)研棒，研至勻漿。

（4）加入10ml生理鹽水，沖洗研磨器；

（5）收集細(xì)胞懸液，并經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，離心沉淀500~800r/min，1~2min，再以生理鹽水水洗3遍，離心沉淀；

（6）固定或低溫保存細(xì)胞懸液，備用。

二、組織活檢、內(nèi)鏡取材標(biāo)本單細(xì)胞懸液的制備

正常組織、瘤組織和淋巴結(jié)等活檢組織以及內(nèi)鏡（胃鏡、食管鏡等）取材標(biāo)本，由于材料較少、制備起來(lái)比較麻煩，但其制備方法與實(shí)體組織基本相似。

1．取材后立即放入盛有少許PBS液的青霉素小瓶中；

2．另取一只小燒杯，杯口用300目尼龍網(wǎng)蓋住，用線繩固定好，并用PBS液濕潤(rùn)；取新鮮組織標(biāo)本置尼龍網(wǎng)上，因標(biāo)本量少，尤其是內(nèi)鏡取材至少要取3塊以上。

3．在操作前，先將剪刀用PBS液浸潤(rùn)一下，然后開始剪碎組織；

4．先剪幾下，視基本無(wú)組織塊存在時(shí)，用原來(lái)裝標(biāo)本的青霉素小瓶中的PBS液，沖洗細(xì)胞勻漿并過(guò)濾于小燒杯中，如果這時(shí)仍有可見組織塊，再用剪刀剪碎，再加適量該P(yáng)BS液沖洗，直至網(wǎng)上無(wú)組織塊為止。這樣可盡量多地收集細(xì)胞。

5．細(xì)胞加固定液或低溫保存，備用。

三、石蠟包埋組織的流式細(xì)胞樣品制備 

外科手術(shù)獲得的新鮮實(shí)體組織，往往已進(jìn)行石蠟包埋處理。石蠟包埋組織單細(xì)胞分散方法的建立，擴(kuò)大了流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍。

1．把石蠟包埋組織切成10~50um厚的組織片3~5片，或用乳缽研成0.5mm直徑大小顆粒狀，放入10ml的試管中；

2．加入二甲苯5~8ml，在室溫下脫蠟1~2天，視石蠟脫凈與否，更換1~2次二甲苯，石蠟脫凈后，棄去二甲苯；

3．水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步為10min，去乙醇，加入蒸餾水3~5ml，10min后棄之；

4．消化：加入2ml 0.5%胰蛋白酶（pH 1.5~2.0）消化液，置37℃恒溫水浴中消化30min，在消化期間，沒(méi)隔10min用振蕩器振蕩1次；

5．消化30min后，立即加生理鹽水終止消化；

6．經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，未消化好的組織可做第二次消化；

7．收集細(xì)胞懸液，離心沉淀1500r/min，再以生理鹽水洗滌1~2次，離心沉淀500~800r/min，去碎片；

8．保存細(xì)胞備用。

四、外周血單個(gè)核細(xì)胞的制備

1．取外周血2ml，肝素抗凝，用生理鹽水將血稀釋成4ml，混勻；

2．將稀釋后的血液沿試管壁徐徐加入4ml淋巴細(xì)胞分離液ficoll到液面之上，勿用力過(guò)大，以免造成血液與分離液混合，保持清晰地分層狀態(tài)；

3．離心2000r/min，30min，室溫18~20℃，離心后可見試管內(nèi)的血液清楚地分為4層，上層為血漿層，中層為分離液層（單個(gè)核細(xì)胞處于血漿層和分離液層中間），底層為紅細(xì)胞層，紅細(xì)胞層上為粒細(xì)胞層；

4．用吸管將上層與中層之間的單個(gè)核細(xì)胞層吸出收集到另1試管中，用生理鹽水洗2遍，每次均以1500r/min，離心10min，棄上清后即得到高純度的單個(gè)核細(xì)胞懸液；

5．用適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汗潭ɑ蛑玫蜏乇浔４娲谩?/span>

五、骨髓細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備

1．無(wú)菌抽取骨髓液0.5ml;

2．將骨髓標(biāo)本滴入含1000U/ml肝素抗凝劑的1ml PBS液中；

3．再加入PBS液稀釋至10ml；

4．用吸管吸取5ml稀釋骨髓液徐徐加入盛有4ml的人類淋巴細(xì)胞分離液液面之上；

5．以上條件下，骨髓有核細(xì)胞分層在PBS-人類淋巴細(xì)胞分離液之間形成的界面上；

6．取有核細(xì)胞層，加入到10ml PBS液中，混勻；

7．以1000r/min離心5min，棄上清，收集骨髓細(xì)胞，加固定液或置低溫冰箱備用。

六、單層培養(yǎng)細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備

1．棄去培養(yǎng)細(xì)胞(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)中的舊培養(yǎng)液，加入1～2ml 0．25％胰蛋白酶，倒置顯微鏡下觀察，見細(xì)胞稍變圓時(shí)，停止胰蛋白酶作用。也可直接觀察培養(yǎng)瓶，靜置消化2～3分鐘，待細(xì)胞逐漸變白，有脫落趨勢(shì)時(shí)，立即豎立培養(yǎng)瓶，停止胰蛋白酶作用，棄去胰蛋白酶；

2．加入3～4ml無(wú)鈣離子和鎂離子的PBS液，用吸管反復(fù)吹打，使其分散為單個(gè)細(xì)胞懸液，移人離心管中；

3．短時(shí)低速離心，即800~1000r/min，離心5min；

4．去掉上清液，加入5~8ml PBS液，低速短時(shí)離心，800~1000r/min，離心3~5min；重復(fù)2~3次，以去除細(xì)胞懸液中的細(xì)胞碎片。

5．加少許PBS液，將沉淀細(xì)胞輕輕吹打均勻。加固定液或低溫保存待用。

七、脫落細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備

在臨床工作中，可以收集到大量自然脫落細(xì)胞，這些細(xì)胞標(biāo)本經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單處理，便可成為較好的單細(xì)胞懸液供流式細(xì)胞術(shù)分析。主要包括脫落細(xì)胞、胸腹水細(xì)胞、尿液、內(nèi)鏡刷檢細(xì)胞等。

（一）食管拉網(wǎng)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液的制備

1．將食管拉網(wǎng)器上的細(xì)胞洗脫到20ml PBS液中，以1500r/min離心后，再用PBS液洗2次，離心500~800r/min，1~2min，棄上清；

2．再加入PBS液5ml，以300目尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾，離心沉淀去上清；

3．加少許PBS液混勻沉淀細(xì)胞，加固定液或低溫保存，備用。

（二）尿液脫落細(xì)胞的單細(xì)胞懸液的制備

1．用以清潔器皿收集24h尿液，置4℃冰箱中自然沉淀2h，輕輕倒去上清液，留下少許帶細(xì)胞的沉淀物，用吸管移至10~20ml離心管中；

2．500r/min離心10min，去上清；

3．加PBS液8~10ml，以1000r/min離心10min，去上清，重復(fù)再洗1次；

4．再加5ml PBS液混勻，用300目尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾，離心沉淀去上清；

5．再加少許PBS液，混勻。加固定液或低溫保存，備用。

（三）胸、腹水脫落細(xì)胞的制備

1．抽取胸、腹水50~100ml，加入1000U/ml肝素液1ml，放鹽水瓶中置于4℃冰箱中靜置6~12h，棄去上清；

2．將底部10~20ml用長(zhǎng)吸管移入試管中，用PBS液洗3次，以1500r/min離心沉淀5min；

3．再加5ml PBS液混勻，用300目尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾，離心沉淀去上清；

4．加少許PBS液，混勻；加固定液或低溫保存，備用。

（四）沖洗液細(xì)胞樣品的制備

1．用300~500ml生理鹽水沖洗膀胱，沖洗一定時(shí)間后，吸出沖洗液放入容器中于冰箱內(nèi)置6~12h；

2．取沉淀液20~40ml，離心沉淀并以生理鹽水洗2次，吸上清；

3．加10ml PBS液，混勻，以300目尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾，離心沉淀去上清；

4．過(guò)濾后1000r/min，10min，離心沉淀，去上清；加固定液或低溫保存?zhèn)溆谩?/span>