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摘要: 研究黃芩對 D-半乳糖致衰老模型大鼠的影響, 初步探討黃芩的抗衰老作用機制。將SD大鼠隨機分為5組, 即空白組、模型組、黃芩低、中、高劑量(分別為 50、100 和 200 mg·kg?1) 組, 采用皮下注射 D-半乳糖(100mg·kg?1)法, 建立亞急性衰老大鼠模型, 并分別評價衰老大鼠的空間學習記憶能力(Morris water maze)和自主活動(open-field test)。采用代謝組學技術對模型大鼠尿液進行NMR數據采集并結合多元統計分析, 探討抗衰老機制。結果表明, 黃芩3個劑量均能改善衰老大鼠的行為能力。多元統計分析結果顯示, 黃芩低中高劑量組能使衰老大鼠尿液中檸檬酸、丙酮酸、乳酸、泛酸、三甲胺和β-羥基丁酸等6個標志物發生不同程度的回調, 主要涉及能量代謝、糖代謝和腸菌代謝等代謝途徑的調節,表明黃芩發揮抗衰老作用與這些途徑相關。
衰老是機體組織、器官功能隨年齡增長而發生的退行性變化,是基因、環境和生活方式等多種因素共同作用的結果。隨著年齡增長,一些疾病例如阿爾茨海默癥、心血管疾病、Ⅱ型糖尿病和癌癥等發生的風險會明顯增加。具有抗衰老活性的天然產物如中藥和植物藥的應用日益廣泛, 這對于抗衰老知識的積累具有重要意義。
代謝組學是研究機體代謝產物譜變化的一種新的系統方法,可通過揭示新陳代謝動態進程中代謝產物的變化規律,全面理解病理變化過程及機體內物質的代謝途徑。目前,基于核磁共振(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)的代謝組學技術已經成為一種強有力的工具,廣泛應用于基礎生物學、分子病理學、臨床診斷、生物醫藥和環境科學等領域。由于衰老過程的復雜性,目前對于衰老的發生機制尚未完全清楚。近年來,包括代謝組學技術在內的高通量技術的應用,為衰老的病理生理學機制提供了新的解釋,并且可以在不同物種中鑒定與衰老相關的特異標志物。
D-半乳糖致衰老模型目前應用最多,該模型具有壽命縮短、學習記憶障礙、神經系統退行性改變、免疫力和繁殖力低下等多種衰老表現,在多種器官組織形態及生理生化的許多指標上呈現出與自然衰老相似的改變,廣泛用于衰老機制研究及抗氧化劑、延緩衰老藥物的藥效學評價。許多研究表明, D-半乳糖致衰老大鼠的自發行為(曠場實驗) 會減少,空間記憶能力也會有損傷(水迷宮實驗)。
本文擬采用D-半乳糖致衰老大鼠模型, 通過行為學考察,驗證黃芩的抗衰老作用, 采用基于1HNMR的代謝組學方法對大鼠尿液代謝物的變化進行測定分析,初步闡明黃芩延緩衰老的作用機制, 為黃芩的開發利用提供一定的理論基礎。
材料與方法
藥材 黃芩藥材購自山西陵川縣六泉中藥材合作社,由山西大學中醫藥現代研究中心秦雪梅教授鑒定為唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi) 的干燥根, 樣品保存于山西大學中醫藥現代研究中心。
動物 SPF級雄性SD大鼠, 體重(180±20) g, 北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,動物許可證號SCXK (京) 2012-0001;動物飼養室保持溫度(23±1.5)℃,相對濕度(45±15)%。動物適應 1 周后開始實驗。
儀器與試劑 Bruker 600-MHz AVANCE III 核磁共振檢測儀(德國布魯克公司); Sartorius BSA124S 分析天平(德國 Sartorius 公司); Morris 水迷宮(上海欣軟公司)；曠場實驗箱（上海欣軟公司）。HPLC分析用甲醇為色譜(Fisher公司); D-半乳糖(Amresco公司),三甲基硅烷丙酸鈉鹽(TSP, Cambridge Isotope Laboratories Inc., MA), NMR 試劑重水(Norell, Landisville, USA), 娃哈哈純凈水。
黃芩提取物制備方法 取黃芩粉末20g,分別用10 倍量的60%乙醇和蒸餾水作溶劑回流提取 2 次, 每次2h,合并兩次提取液,減壓回收溶劑,冷凍干燥得粉末。分別取黃芩水提物和醇提物適量,按照藥典方法測定黃芩苷的含量,以其含量的高低作為溶劑選擇的依據。
動物實驗 雄性SD 大鼠 50 只,隨機分為空白組,模型組,黃芩低、中、高劑量組,每組10只。模型組與黃芩低、中、高劑量組每天皮下注射D-半乳糖 100 mg·kg?1,連續 10 周,空白組注射等體積的生理鹽水。黃芩低、中、高劑量組每天分別按劑量50、100 和 200 mg·kg?1灌胃給藥, 空白組與模型組每天灌胃等體積的蒸餾水,連續10 周。
行為學考察
曠場實驗 曠場實驗于造模第10 周進行,將大鼠放入曠場行為測試箱的中心位置,適應 2min后,觀察 4min 內大鼠的直立次數、靜止時間和穿越格數。
Morris 水迷宮實驗曠場實驗結束后,開始 Morris水迷宮實驗。采用XR-XM101型Morris 水迷宮視頻分析系統進行測試,實驗器材由圓形水池和自動錄像分析系統兩部分組成。圓形水池由ABS制成,直徑160 cm,高 50 cm。水池被等分為4 個象限, 水深30cm,平臺位于任一象限的中間,且表面低于水面l～2 cm。水溫保持在25℃左右。池上方的攝像機同步記錄大鼠的運動軌跡。經Supermaze軟件分析處理, 得到實驗數據。水迷宮實驗環境要求安靜,避免一切外界干擾,保持房間安靜,溫度適宜,光線柔和,實驗期間迷宮外的參照物始終保持不變以供大鼠定位。
實驗程序參照Morris等的方法進行,測試包括: ① 定位航行實驗, 用于測量大鼠對水迷宮學習和記憶的獲取能力,即記錄其潛伏期。歷時5 天,訓練時隨機選擇一個象限將大鼠面向池壁放入水中, 迫使大鼠學習尋找設于水面以下的平臺。電腦中記錄 60 s 內尋找平臺所需時間即潛伏期。如果60 s 內未能找到平臺,可將其引導至平臺并在平臺停留 20 s, 潛伏期記錄為 60 s。每天訓練 4 次,每次訓練間隔10 min。系統自動記錄多項參數; ② 空間探索實驗, 用于測量大鼠學會尋找平臺后,對平臺空間位置記憶的保持能力。定位航行實驗結束后撤去平臺,將大鼠面向池壁任選一個入水點放入水中,可以記錄60 s內穿越原平臺位置的次數及在目標象限的活動路程和活動時間并進行比較分析。數據收集和處理由Morris水迷宮系統軟件完成。
樣品采集與制備及測定條件 尿樣采集與儲存: 所有大鼠于第10周末晚上 18:00 至第二天早上 8:00放入代謝籠,冰上收集尿液, 12 000 r·min?1離心,取上清液,于?80℃儲存。
樣品前處理: 解凍樣品,搖勻, 在4 ℃下12000 r·min?1離心 10 min,取尿液0.4 m L,置于核磁管,加PBS (p H 7.0) 0.2 m L, 再加入 D2O 0.1 m L,放置 10 min, 進行核磁測定。
樣品于 600 MHz NMR(25 ℃)儀上測定,采用NOE-2DSpectroscopy (NOSEY)脈沖序列。測定頻率為600.13 MHz,掃描次數為64,譜寬12345.7 Hz,脈沖時間14 s,采樣時間2.654 s,延遲時間1.0 s,采樣數據點65536, FID 分辨率0.188 Hz,采樣間隔40.5 s,內標為TSP。
1HNMR 譜圖數據處理與分析 核磁圖譜采用Mest Re Nova (version 8.0.1, Mestrelab Research, Santiago de Compostella, 西班牙) 進行處理。所有光譜進行手動相位、基線調整。圖譜中,以TSP的化學位移δ 0.00為標準進行定標,以δ 0.04對化學位移區間 δ0.00～9.40進行分段積分,其中 δ 4.60～5.00 (殘余水峰,尿素峰) 不進行積分,并將積分數據進行歸一化,導入Excel軟件中進行下一步多元統計分析。將上述處理的積分數據導入SIMCA-P13.0(Umetrics, Sweden)軟件中進行主成分分析(principal component analysis, PCA),再用偏最小二乘法判別分析 (partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(Orthogonal PLS-DA, OPLS-DA)找出樣品間差異代謝產物。
統計學處理 數據采用 SPSS 17.0 軟件處理,以x ±s 表示,采用單因素方差分析及t 檢驗對行為學指標及差異代謝產物進行統計學分析和比較,以 P< 0.05, P<0.01 為差異具有顯著性。
討論
本研究復制了衰老模型,使大鼠明顯出現了以學習記憶能力下降為主要表現的認知功能障礙。
尿液是機體整體代謝終產物輸出的主要途徑之一, 尿液中代謝物的變化不僅能夠反映機體整體代謝的特征,還可能是局部組織或器官功能異常的外在表現。本研究采用1H NMR分析手段檢測出20多種尿液中代謝產物,主要包括脂肪酸類、氨基酸類和有機酸類等代謝產物。
本研究進行組間兩兩比較發現,檸檬酸、乳酸、泛酸、三甲胺、α-酮戊二酸、丙酮酸、β-羥基異戊酸和β-羥基丁酸受D-半乳糖影響較大,可能為D-半乳糖致衰老模型的潛在生物標志物。給予黃芩干預后,檸檬酸、乳酸、泛酸、丙酮酸、三甲胺和β-羥基丁酸有不同程度的回調, 其中以黃芩高劑量效果最為顯著。
通過對潛在生物標志物分析,發現黃芩延緩衰老主要涉及兩條代謝路徑: 三羧酸(TCA)循環和丙酮酸代謝。TCA循環產生的ATP 是組織細胞能利用的主要能源來源,在這一過程中產生的ATP 都是經由呼吸鏈產生的,模型組中 TCA 循環的中間體檸檬酸和 α-酮戊二酸均降低, 說明機體衰老也使得TCA能量代謝水平降低,其中間代謝物水平也相應降低。研究表明,如果與能量代謝相關的基因下調會造成能量產生減少,損傷ATP依賴的下游過程,如突觸結構和功能的完整,泛素依賴的蛋白降解途徑,而這兩者都在阿爾茨海默癥(AD)中受影響。
丙酮酸是體內產生的三碳酮酸,在三大營養物質的代謝聯系中起著重要的樞紐作用。丙酮酸的變化對于評價體內炎癥發生有重要的作用。在炎癥時,即使有氧條件下機體優先進行丙酮酸轉化為乳酸的代謝, 這種現象被稱為有氧糖酵解或Warburg 效應。丙酮酸的變化與糖酵解及TCA 循環等密切相關。D-半乳糖刺激時,丙酮酸明顯增加,其原因是糖酵解和TCA 循環發生障礙。黃芩可以降低尿液中丙酮酸的含量,使糖酵解和TCA 循環代謝恢復。
丙酮酸代謝和TCA循環都發生在線粒體內,這就提示黃芩可能通過代謝路徑的調節促進線粒體呼吸,保護線粒體功能,最終與延緩衰老有關。線粒體廣泛分布于各種真核細胞內,是進行氧化代謝的部位,是糖類、脂肪和氨基酸代謝釋放能量的場所。除為細胞活動提供能量外, 線粒體還參與一些重要代謝通路,參與細胞凋亡、信號轉導調控等生化功能,大量實驗研究表明線粒體在衰老進程中發揮著至關重要的作用。
與空白組相比,模型組中乳酸含量升高。在認知嚴重損傷的犬和早發性AD患者中也出現類似的結果,乳酸含量是正常組的4 倍。乳酸水平的升高不僅說明糖異生、碳水化合物和能量代謝發生變化,還說明腦中糖代謝損傷,這是造成認知損傷的一部分原因。此結果與行為學結果吻合。
三甲胺是由膽堿和肉堿在腸道細菌酶作用下的降解產物,腸道菌群代謝的改變與衰老相關的疾病有關。模型組三甲胺含量升高,表明隨著年齡的增長,腸道菌群代謝會發生紊亂。而黃芩高劑量可以降低三甲胺含量,說明黃芩發揮抗衰老作用與調節腸道菌群的正常代謝有關。
本研究結果表明,黃芩對衰老大鼠的記憶損傷及自發行為的下降均有改善,黃芩延緩衰老的作用機制可能與調節能量代謝、糖代謝和腸菌代謝等代謝途徑有關。
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